Bei Bacillus subtilis handelt es sich um einen grampostiven, stäbchenförmigen Endosporenbildner. Das Bakterium dient in der Industrie als Produktionsorganismus für diverse Substanzen, unter anderem für die Produktion von Riboflavin. Im Biosyntheseweg von Riboflavin gibt es einen Reaktionsschritt (Dephosphorylierung von 5-Amino-6(D)-ribitylamino(1H,3H)pyrimidindion-5‘-phosphat) für den noch vor wenigen Jahren kein zuständiges Enzym bekannt war. Durch Vorarbeiten an der HAMBURG SCHOOL OF FOOD SCIENCE wurde festgestellt, dass Mitglieder der s.g. HAD-Superfamilie in der Lage sind diesen Schritt zu katalysieren, insbesondere die Enzyme YcsE, YitU und YwtE.
Mit Hilfe der CRISPR-Cas9 Technologie konnten entsprechende Gene im Genom von B. subtilis sowohl einzeln als auch kombinatorisch ausgeknockt werden. Die generierten Mutanten werden massenspektrometrisch in einem Metabolomics-Ansatz untersucht, welcher sich in zwei unterschiedliche Aspekte unterteilen lässt. Für die non-targeted Analyse werden hypothesenfreie metabolische Fingerprints der Mutanten und des Wildtypen aufgenommen und mit Hilfe von Multivariater Datenanalysen miteinander verglichen. Der targeted Aspekt der Analyse bezieht sich auf die Verwendung einer speziell zugeschnittenen Standardbibliothek, um den Einfluss der zu untersuchenden Enzyme und ihren Wirkungsgrad auf das Metabolom zu erfassen.
Im Rahmen der ersten Förderungsperiode des Projektes, mit Außnahme der erwähnten B. subtilis Mutanten, konnte ebenfalls ein Workflow zur effizienten Extraktion der Metaboliten aus B. subtilis erarbeitet werden. Begleitend hierfür wurden weitere Parameter zur Validierung der Extraktion entwickelt und optimiert wie beispielsweise der Adenylate energy charge (AEC) oder die Cell dry weight (CDW).